人源蛋白CAP的串联SH3结构域与细胞骨架蛋白vinculin相互作用的结构生物学研究

【摘要】人源蛋白CAP(又称为Ponsin),属于vinexin蛋白家族,是一个重要的参与细胞骨架调节的接头蛋白。在功能方面,CAP对细胞粘着斑(focaladhesion)的形成及其动态变化的调控有重要的意义。而CAP与细胞骨架蛋白vinculin的相互作用对CAP在粘着斑处的细胞定位和它的功能的正常行使是必不可少的。但是目前CAP和vinculin相互作用的结构基础还不太清楚。Vinexin家族蛋白的结构组成高度保守,它们在N末端都有一个SoHo结构域,而C末端包括三个串联的SH3结构域。另一方面,Vinculin是一个由1066个氨基酸组成的细胞骨架接头蛋白,它是由D1,D2,D3,D4,D5五个结构域组成,其中D1-D4结构域组成vinculin的头部,而D5结构域被看作vinculin的尾部结构域。Vinculin的头部结构域和尾部结构域之间通过一段富含脯氨酸的柔性区域连接。根据文献报道,CAP的C末端的第一个和第二个SH3结构域负责与vinculin的富含脯氨酸的柔性区域结合。我们利用核磁共振波谱学技术解析了CAP的第一个和第二个SH3串联结构域的溶液结构。进一步,我们通过ITC和化学位移扰动实验找到了CAP在vinculin上确切的结合位点,并且发现CAP的SH3串联结构域对底物有不同的选择特异性。CAP结合vinculin的时候是两个SH3结构域同时结合到vinculin的富含脯氨酸的序列。我们同时解析了两个SH3结构域分别与各自底物的复合物晶体结构,通过结构分析找到了决定两个SH3结构域viculin结合选择特异性的关键残基,Q807SH3a和D881SH3b,通过对这两个位点进行单点残基突变进一步验证了上述实验结果。我们通过核磁共振NOE实验,核磁主链弛豫实验和残留偶极耦合(RDC)实验对串联SH3结构域在自由状态和结合底物状态下的结构变化和动力学性质进行了分析。结果发现,串联SH3结构域在自由状态下两个结构域之间不存在任何结构域间相互作用,而在底物结合状态下,虽然在底物束缚下两个结构域变得更加收敛但是仍然没有固定的相对取向。在功能上,vinculin存在从自抑制状态到激活的过程,该过程涉及vinculin结构上头部和尾部之间较大尺度的构想变化。为了了解CAP对vinculin的激活的影响,我们进一步利用小角散射、电镜实验、和分子动力学模拟技术得到了CAP与vinculin全长蛋白的复合物分子模型,并且分析了可能存在的构象变化。我们也通过超速离心共沉淀实验来检测CAP是否可以帮助vinculin结合F-actin(vinculin只有在激活状态才会结合F-actin)。然而,我们的超速离心共沉淀实验结果无法证明CAP可以激活vinculin。考虑到vinculin的激活机制比较复杂,可能是多个底物共同参与的结果,因此要想知道CAP对vinculin激活的影响,仍需要通过更多更深入的研究来探讨。
【作者】赵德彪；
【导师】吴季辉；施蕴渝；
【作者基本信息】中国科学技术大学，结构生物学，2014，博士
【关键词】CAP；vinexin家族；SH3结构域；vinculin；粘着斑；

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